小檗碱和卤代苄基异喹啉生物碱的代谢工程合成-文献精读79

De novo biosynthesis of berberine and halogenated benzylisoquinoline alkaloids in Saccharomyces cerevisiae

在 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中从头合成小檗碱和卤代苄基异喹啉生物碱

小檗碱的酵母代谢工程生物合成-文献精读78

苄基异喹啉类生物碱的微生物合成-文献精读77

摘要

小檗碱是一种广泛应用的苄基异喹啉生物碱（BIA）类药物，来源于植物。微生物制造已成为获取这些高价值BIA的一种有前途的方法。在本研究中，我们通过在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中工程化19个基因（包括来自植物和细菌的12个外源基因），实现了小檗碱的完整生物合成。通过过表达瓶颈酶、扩大发酵规模以及发酵后的加热处理，我们将小檗碱的产量提高了643倍，达到1.08 mg L⁻¹。此外，该途径展示了将卤代酪氨酸引入合成非天然BIA衍生物的高效能力，这些衍生物具有更高的治疗潜力。我们首次通过九个酶促反应在体内合成了11-氟四氢非洲防己胺。我们的途径还表现出高度的效率和灵活性，使得可以同时引入两种含氟的酪氨酸衍生物以合成8, 3’-二氟乌药碱。该研究凸显了酵母作为多功能微生物生物合成平台的潜力，有助于加强现有的药物供应链并推动药物开发进程。

引言

小檗碱是一种源自植物的苄基异喹啉类生物碱（BIA），具有多种药理活性。它对包括结核分枝杆菌和金黄色葡萄球菌等致病细菌以及流感病毒和疱疹病毒等病原体展现了广谱的抗菌和抗病毒作用。近年来，研究发现小檗碱还具有治疗肥胖、调节肠道微生物群、治疗动脉粥样硬化以及改善帕金森病的潜力。全球已有超过80项临床试验研究小檗碱在这些疾病中的药用潜力，包括其抗癌、心脏保护和抗炎作用。

小檗碱的生产主要依赖从药用植物中提取和分离。多种药用植物（如白毛茛、刺檗和黄连属植物）可以将小檗碱作为重要的特化代谢产物进行合成。这些药用植物在印度传统医学（阿育吠陀）、中医和中东传统医学中被广泛使用，用于治疗伤口感染和腹泻等疾病。然而，从植物中提取小檗碱完全依赖于耗时的农业过程，并且易受环境变化的影响。同时，化学合成小檗碱的过程对环境不友好，而且由于小檗碱结构的复杂性，化学合成过程仍然充满挑战。尽管已有几种小檗碱的化学合成方法被报道，但复杂的合成步骤和重金属的使用阻碍了其未来的生产应用。

微生物制造为解决植物或化学合成途径的挑战提供了一种新的策略。在可操作的微生物宿主（如酿酒酵母）中进行发酵，更加快速、经济、高效且环保。酵母已被证明是生产高价值且结构复杂的植物天然产物（PNPs）的一种强大平台，如青蒿素、大麻素、天仙子碱和长春碱。作为模式真核微生物，酵母提供了内膜系统，能够功能性地表达植物中膜结合酶（如细胞色素 P450）。酵母完善的内源代谢途径和先进的基因工具使得在酵母中重建和工程化外源代谢途径成为可能。此外，酵母中的体内生物合成过程使得生产具有更高生物活性和生物利用度的定制化植物天然产物衍生物成为可能。在酵母中通过酶促转化修饰小分子底物，能够合成非天然的植物天然产物；在已建立的植物天然产物生物合成途径中加入定制酶（如卤化酶）可以基于PNP骨架进行新的结构修饰。这些策略已经实现了几种卤化的药用BIAs和单萜吲哚生物碱（MIAs）的合成。这些方法特别适用于改善小檗碱及其他BIA的药代动力学特性。尽管小檗碱具有广泛的治疗用途，但其膜透过性较差，使得口服生物利用度低于5%。卤化是药物研发中增加植物天然产物生物利用度和生物活性的重要策略。尤其是氟化在药物化学中具有重要意义，因为氟取代可以显著提高先导化合物的结合效力和选择性。可以预见，在酵母中生产卤代的BIA衍生物将显著推动药物研发和发现。多种具有经典苄基异喹啉结构的卤代BIA已通过体内或体外方法合成。已有体外酶法用于合成多种去甲乌药碱和乌药碱的衍生物。但这些化合物的下游卤代BIA的体外合成尚未实现，可能是由于必需的膜结合细胞色素P450酶的表达困难。基于已建立的BIA生物合成途径的体内方法允许合成更复杂的BIA（如牛心果碱），但要生物合成更复杂的结构（如卤代原小檗碱）仍具有挑战性。

小檗碱的生物合成途径已经在酵母中部分重建，利用底物全去甲劳丹碱，获得的小檗碱产量为39 µg L⁻¹。然而，产量的限制和底物全去甲劳丹碱的使用阻碍了进一步的工业应用。随着植物基因组学、生物信息学和合成生物学的发展，已在酵母中鉴定并重建了与小檗碱具有相似合成途径的BIA（如牛心果碱、罂粟碱和血根碱）的从头生物合成途径。这些先驱性研究证明了从头设计一个高效的小檗碱生产菌株的可行性。

在本研究中，我们在酵母中重建了一个完整的小檗碱生物合成途径。初始菌株被工程化，包含15种酶，其中包括来自植物和细菌的12种外源酶，能够从葡萄糖生产出1.68 µg L⁻¹的小檗碱。通过优化限速酶的表达，小檗碱产量提高了20倍，达到35.1 µg L⁻¹。在0.75升生物反应器中进行批次发酵，并在发酵后进行加热处理以促进转化，小檗碱产量最终提高至1.08 mg L⁻¹，为初始产量的643倍。我们还通过在优化的生产菌株中加入卤代酪氨酸（如3-氟-酪氨酸、3-氯-酪氨酸和3-碘-酪氨酸），展示了几种新型卤代BIA的生产能力。工程化的酵母表现出对氟代酪氨酸衍生物的高度兼容性，成功生产出含氟的四氢小檗胺，这是首次通过九个酶促反应在体内合成卤代原小檗碱。此外，工程化的BIA生物合成途径还能将两种含氟的酪氨酸衍生物缩合并修饰为二氟BIA产物。本研究开发的从头小檗碱生产酵母菌株和发酵策略，将提供一种经济、可控且稳健的小檗碱供应链，同时提供一个高效的酵母平台，用于合成未来药物开发中难以获得的卤代BIA。

结果

在酵母中构建从头小檗碱生物合成途径

我们在酵母中构建了包含四个模块的从头小檗碱生物合成途径（图1），共使用了12种外源酶。

• 模块 I：通过优化酵母的内源芳香酸生物合成途径过量生产L-酪氨酸，这一途径在之前的研究中已建立。此模块在菌株中过表达了酵母内源的转酮醇酶1（TKL1）、磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖醛缩酶变体（ARO4Q166K）和莽草酸变位酶变体（ARO7T226I），并使用了抗生素潮霉素抗性标记（HygR），得到的菌株命名为ySL1440。

• 模块 II：形成BIA骨架去甲乌药碱（norcoclaurine），该模块包含四种酶：酪氨酸羟化酶（TyrH）、细胞色素P450还原酶（CPR）、二羟基苯丙氨酸脱羧酶（DoDC）和去甲乌药碱合酶（NCS）。先前研究报道了哺乳动物和植物的TyrH。我们选择了源自甜菜（Beta vulgaris）的植物TyrH（CYP76AD5），因其在先前研究中展示出较高的活性。结合来自拟南芥的细胞色素P450还原酶（CPR，命名为ATR1）、来自黄连（Coptis japonica）的NCS（N端35个氨基酸已截短）、来自假单胞菌（Pseudomonas putida）的DoDC和His5营养缺陷标记，将这些基因整合到ySL14的YGL157W（ari1）位点，得到菌株BBR1。ari1基因编码醛还原酶，导致去甲乌药碱前体4-羟基苯乙酸（4HPAA）的降解，因此在整合过程中删除了该基因。在YPD培养基中于30℃培养菌株三天后，通过高分辨率液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析培养上清液，验证了BBR1菌株中从头合成的去甲乌药碱（补充图S1a）。

• 模块 III：将去甲乌药碱转化为牛心果碱（reticuline），这是BIA途径中的关键中间体。此模块包含四种酶：来源于鸦片罂粟（Papaver somniferum）的去甲乌药碱6-O-甲基转移酶（6OMT）、N-甲基化乌药碱转移酶（CNMT）、3'-羟基-N-甲基乌药碱4'-O-甲基转移酶（4'OMT）和来源于加州罂粟（Eschscholzia californica）的N-甲基乌药碱3'-羟化酶（NMCH），并使用了Leu2营养缺陷标记，将这些基因整合到BBR1的YMR318C（adh6，编码一种降解4HPAA的醇脱氢酶）位点，得到菌株BBR2，且验证了牛心果碱的生产（补充图S1b）。

• 模块 IV：将牛心果碱转化为小檗碱的模块。此模块包含四种酶：小檗碱桥酶（BBE）、来自P. somniferum的金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶（S9OMT）、来自C. japonica的四氢小檗碱合酶（CAS）、以及来自Wilson小檗（Berberis wilsoniae）的四氢原小檗碱氧化酶（STOX），并使用Ura3标记，将这些基因整合到BBR2的YDR368W（ypr1，一个降解4HPAA的醛酮还原酶）位点。最终得到的小檗碱生产菌株BBR3包含19个修饰或工程化的基因，其中15个基因过表达，4个内源基因被删除。该菌株在YPD培养基中30℃培养三天后，生产217.61 µg L⁻¹的四氢小檗碱和1.68 µg L⁻¹的小檗碱（图2a, b）。

块状箭头表示酶催化的反应。绿色箭头表示植物酶；粉色箭头表示细菌酶；黄色箭头表示过表达和改造的酵母酶；灰色箭头表示未改造的酵母酶。蓝色边框的箭头表示细胞色素P450酶。带红色斜杠的箭头表示被敲除的酶。

酶缩写：

• Aro10p：苯丙酮酸脱羧酶

• Aro1p：五功能芳香族酶

• Aro2p：双功能莽草酸合酶和黄素还原酶

• Aro4pQ166K：突变的磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖醛缩酶（解除酪氨酸抑制）

• Aro7pT226I：突变的莽草酸变位酶（解除酪氨酸抑制）

• Aro8p：芳香族氨基转移酶I

• Aro9p：芳香族氨基转移酶II

• BBE：小檗碱桥酶

• CAS：四氢小檗碱合酶

• CNMT：N-甲基化乌药碱转移酶

• CPR：细胞色素P450还原酶

• DODC：L-DOPA脱羧酶

• NCS：去甲乌药碱合酶

• NMCH：N-甲基化乌药碱羟化酶

• STOX：四氢原小檗碱氧化酶

• S9OMT：金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶

• Tkl1p：转酮醇酶

• Tyr1p：前苯酸脱氢酶

• TyrH：酪氨酸羟化酶

• 4′OMT：3′-羟基-N-甲基乌药碱4′-O-甲基转移酶

• 6OMT：去甲乌药碱6-O-甲基转移酶

化合物缩写：

• DAHP：3-脱氧-D-阿拉伯糖-2-庚酮酸7-磷酸

• E4P：赤藓糖4-磷酸

• L-DOPA：L-3,4-二羟基苯丙氨酸

• NMC：N-甲基化乌药碱

• PEP：磷酸烯醇式丙酮酸

• THCB：四氢小檗胺

• 4HPAA：4-羟基苯乙醛

• 4-HPP：4-羟基苯丙酮酸

• PPP：戊糖磷酸途径

• 

生产

• (a) 在菌株BBR3中生产小檗碱，以及 (b) 生产四氢小檗碱。显示了小檗碱（m/z 336.123）和四氢小檗碱（m/z 340.154）的提取离子色谱（EIC）。色谱图为三个生物重复的代表性结果。

• (c) 在优化菌株BBR4R中小檗碱的产量，与原始菌株BBR3R比较。 (d) 四氢小檗碱在优化菌株中的产量。使用双尾t检验计算p值：*p < 0.05和**p < 0.01。

• (e) 在本氏烟草瞬时表达系统中筛选活性STOX，并渗入四氢小檗碱。

• (f) 在加热条件下小檗碱和可能的中间体浓度增加。独立实验，n = 3。误差条表示标准偏差。

代谢通量优化

由于 BBR3 菌株中已占用了三个营养缺陷标记（His5、Leu2 和 Ura3）和一个抗生素标记 HygR，我们通过 Cre-LoxP 系统回收了这些标记，以便进一步工程化。回收后的菌株命名为 BBR3R，与 BBR3 菌株相比，小檗碱的产量相同（1.39 µg L⁻¹），表明这些标记不会影响 YPD 培养基中的 BIA 合成。NCS、4'OMT 和 CAS 被报道为瓶颈步骤。我们在 YDR541C 位点整合了包含 Leu2 和这三种酶的额外拷贝，以优化代谢通量。该位点根据之前的研究是另一个4HPAA降解基因，从而得到菌株 BBR4。随后回收了 BBR4 中的 Leu2 标记，得到新菌株 BBR4R。优化后的菌株 BBR4R 产生的 35.10 µg L⁻¹ 小檗碱，比原始菌株 BBR3R 高出20倍（图2c）。在 BBR4R 中，四氢小檗碱的产量也增加了5倍，达到 989.10 µg L⁻¹（图2d）。

四氢小檗碱的大量积累和相对较低的小檗碱产量表明由 STOX 催化的四氢小檗碱向小檗碱的转化是另一个主要瓶颈。我们首先尝试在 BBR4R 中使用高拷贝质粒（如 pAG424 和 pAG425）过表达来自 Wilson 小檗的 STOX（BwSTOX），以提高转化率。然而，在携带 STOX 表达质粒的菌株中未检测到小檗碱的积累。由于这些菌株必须在合成缺失（SD）培养基中培养以维持质粒，SD 培养基中较低的 pH 值或营养成分少可能导致小檗碱未产生。因此，我们将酵母高拷贝质粒 pAG425 上的原始营养缺陷 Leu2 标记替换为抗生素潮霉素 B 抗性标记（HygR），得到新质粒 pAG42H，使得菌株可在含潮霉素 B 的 YPD 培养基中选择性生长。尽管在 pAG42H 质粒上过表达了 BwSTOX，但仍未提高转化率，表明 BwSTOX 在酵母中不活跃，这与之前研究的假设一致。

为了确认 BwSTOX 的不活跃性是否由于与酵母表达系统的不兼容，我们通过瞬时表达在模式植物本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中验证了酶的活性。使用含 BwSTOX 的农杆菌 GV3101 侵染本氏烟草叶片。同时，我们还侵染了来自黄连（CjSTOX）和罂粟（PsDBOX）的其他 STOX 变体，以筛选更多的 STOX 候选基因。基因表达四天后，将四氢小檗碱作为底物渗入。24小时后从叶片中提取代谢物并通过 LC-MS 分析。仅 CjSTOX 显示活性，表现为较高的小檗碱和较低的四氢小檗碱浓度（图2e），相比之下对照组无 STOX。然而，在酵母中过表达 CjSTOX 仍未增加小檗碱产量。尽管我们进行了多种故障排查，包括将 CjSTOX 与 mCherry 蛋白融合以确认表达（补充图S2a），通过信号肽工程将 CjSTOX 定位于内质网或液泡（补充图S2b和S2c，方法见补充方法）以及添加高浓度的四氢小檗碱，但在酵母中未观察到 CjSTOX 将四氢小檗碱转化为小檗碱的活性。

化学氧化提高小檗碱产量

由于在酵母系统中缺乏活性的 STOX，我们推测小檗碱是通过自发的化学反应生成的，这一点在之前以全去甲劳丹碱为底物的研究中也有所讨论。因此，我们继续在温和条件下优化转化以获得更高的小檗碱产量。通过初步试验发现温度是化学反应中的重要参数。将 1 mg L⁻¹ 的四氢小檗碱溶于水后在 55 °C 或 98 °C 下加热4小时。在两种条件下都观察到四氢小檗碱的消耗和小檗碱的生成，且 98 °C 下的处理显示出 40.3% 的转化率，高于 55 °C 下的 1.90% 转化率（补充图S3a）。然后我们将菌株 BBR4R 的培养上清液在 98 °C 下加热36小时，并在 4、8、12、16、20、26、30、36 小时采样进行 LC-MS 分析。处理前上清液中含有 1.06 mg L⁻¹ 的四氢小檗碱和 49.5 µg L⁻¹ 的小檗碱。处理过程中，小檗碱浓度逐渐增加，四氢小檗碱浓度在前4小时降至 88.9 µg L⁻¹，并持续减少。加热后得到 721 µg L⁻¹ 的小檗碱，几乎所有四氢小檗碱都被消耗（图2f）。类似于通过去除4个氢原子将四氢小檗碱转化为小檗碱的氧化过程，我们还发现四氢小檗胺（THCB, m/z 342.170）可能被转化为假定的乌药碱（m/z 338.139）（图2f）。可能的机制和分子结构见补充图S3b。

发酵放大实验

为了进一步评估该小檗碱生产菌株的可扩展性和工业应用潜力，我们在2.5升的Eppendorf BioFlo 310生物反应器中进行了三批0.75升规模的发酵实验。将菌株 BBR4R 在30°C的YPD培养基中培养5天，生产了708.3 µg L⁻¹的小檗碱和1.15 mg L⁻¹的四氢小檗碱，最终 OD600 达到48.5（图3）。与小规模培养相比，生物反应器中的小檗碱产量提高了20倍，从35.1 µg L⁻¹增加到708.3 µg L⁻¹。我们推测，生物反应器中改进的供气和搅拌提高了氧气的传递，促进了四氢小檗碱向小檗碱的自发化学氧化。随后，将培养上清液在98°C下加热36小时，最终实现了1.08 mg L⁻¹的小檗碱产量，同时四氢小檗碱被完全消耗（图3）。与之前在酵母中从全去甲劳丹碱生产小檗碱（39 µg L⁻¹）的报道相比，我们的工作使小檗碱的产量提高了26.7倍，达到了1.08 mg L⁻¹，并且以葡萄糖为底物。

在生物加工期间的小檗碱产量、四氢小檗碱产量和 OD600 值以及随后的36小时加热过程显示于图中。误差条表示72小时之前的三个独立发酵的标准偏差，72小时之后为两个独立发酵的标准偏差。

卤代 BIA 衍生物的生产

化学修饰（如卤化）可以改变天然产物的生物利用度，并改善其药理活性。基于我们的酵母小檗碱生产平台，我们进一步探索了其生产具有更高药用潜力的卤代 BIA 衍生物的可行性。将菌株 BBR4R 在含有 100 mg L⁻¹ 3-氟-酪氨酸的 3 mL SD-Tyr 培养基中培养，作为底物。30°C 下在试管中培养三天后，通过 LC-MS 分析培养基。观察到两个具有单一 F 取代的乌药碱衍生物，推测分别为 8-F-乌药碱和 3'-F-乌药碱，这两个峰的质荷比为 m/z = 304.134，保留时间分别为 6.45 分钟和 10.23 分钟（图4b）。串联质谱（MS/MS）显示两个峰具有不同的碎裂谱。通过比较原始乌药碱的碎裂谱，发现 F-乌药碱有两种不同的结构：（i）F 取代在异喹啉环上，或（ii）F 取代在苄基环上（补充图 S5）。这些结果表明 3-F-酪氨酸分别通过两个前体整合到 BIA 骨架中，即通过 3-F-多巴胺进入异喹啉环，生成 8-F-乌药碱，或通过 3-F-4HPAA 进入苄基环，生成 3'-F-乌药碱（图4和补充图 S4）。

只有 3'-F-乌药碱进入了下游途径，生成 3'-F-N-甲基乌药碱（3'-F-NMC, m/z 318.150）和 3'-F-牛心果碱（m/z 348.161），分别通过提取离子色谱（EIC）在 50 ppm 下和 MS/MS 确认（图4c, d 和补充图 S6, S7）。这表明乌药碱之后的酶 CNMT 可能更偏好从 3-F-4HPAA 途径产生的 F-BIAs。本研究中构建的 BBR4R 菌株倾向于 3-F-4HPAA 途径，而非 3-F-多巴胺途径，这可能是由于四个 4HPAA 降解基因的删除以及甜菜（B. vulgaris）TyrH 酶的底物偏好。我们观察到可能为 11-F-金黄紫堇碱（m/z 346.145, 50 ppm）和 11-F-THCB（m/z 360.161, 50 ppm）的峰（图4e, f 和补充图 S8, S9），而之前的研究仅观察到卤代牛心果碱，尽管在体外研究中报道了下游酶 BBE 的底物适应性。这一发现首次证明卤代 BIA 可以在体内整合至牛心果碱下游的原小檗碱途径中，并且 BBE 的底物适应性能够接受 3'-F-牛心果碱以合成下游 BIA。所有 F-BIA 的保留时间均比对应的原始 BIA 大约长1分钟，表明其疏水性增加，这与 F-BIA 的鉴定结果一致，因为含氟碳链被报道比碳氢链更具疏水性。F-BIA 的疏水性可能有助于改善药物在人体内的运输，例如增强血脑屏障的通透性。

从3-F-酪氨酸出发的F-BIA半生物合成途径示意图。显示了多巴胺途径（蓝线）和4HPAA途径（绿线）。目标化合物的高分辨率提取离子色谱（EIC）包括：(a) 8, 3’-二氟-乌药碱，(b) i) 8-F-乌药碱，ii) 3'-F-乌药碱，(c) 3'-F-NMC，(d) 3'-F-牛心果碱，(e) 11-F-金黄紫堇碱，(f) 11-F-THCB。EIC是根据目标化合物的计算质荷比 (M + H)+ 提取的，质量精度在100 ppm以下。色谱图代表三个生物重复的结果。

令人惊讶的是，我们还观察到一个峰，其质荷比与8, 3'-二氟-乌药碱（m/z 322.125，50 ppm）相符（图4a），并通过MS/MS确定了其结构，显示氟位于异喹啉环和苄基环上（补充图S5）。这表明NCS酶能够将两个前体3-F-多巴胺和3-F-4HPAA同时缩合，尽管二氟-乌药碱的峰面积仅为单氟取代BIA的2%。

我们还测试了该途径中3-氯-酪氨酸和3-碘-酪氨酸的整合，成功生产了3'-Cl-NMC、3'-Cl-牛心果碱和3'-I-NMC（补充图S10）。Cl和I的整合效率较低，可能是由于更大的空间位阻。

最后，我们在0.75升生物反应器发酵中验证了F-BIA生产的可扩展性。对三条途径终产物的定量分析显示，生物反应器中的批次发酵显著提高了F-BIA的合成。经过四个酶促反应后，8, 3'-二氟-乌药碱和8-F-乌药碱分别增加了1.6倍和1.9倍（根据相对EIC峰面积估算）。经过九个酶促反应后，11-F-THCB增加了17倍，表明生物反应器发酵对该途径优化效果最好（补充表S2）。在不同位置引入不同卤素基团生产这些卤代BIA，突显了酵母中重建途径作为生产新型BIA衍生物平台的潜力，通过底物添加方式为药物发现和开发提供了一种替代途径。

讨论

在本研究中，我们展示了酵母中小檗碱的完整生物合成途径。工程化的酵母菌株包含12种来自植物或细菌的外源酶，以及过表达的三种酵母内源酶，以增强酪氨酸的供应，并通过删除四种酵母内源酶以减少4HPAA前体的竞争。通过对19个基因的工程改造和加热的化学转化，小檗碱在生物反应器发酵中的产量达到1.08 mg L⁻¹。这表明酵母发酵具有作为植物天然产物工业供应链的可行性，未来可以通过酶工程、菌株工程和生物工艺优化进一步提升产量。特别地，我们还在发酵过程中通过加入3-F-酪氨酸，成功生产了多种新型卤代BIA化合物，如3'-F-金黄紫堇碱、11-F-THCB和8, 3'-二氟-乌药碱，这凸显了酵母发酵在为药物开发提供定制BIA衍生物方面的价值。

氧化芳构化是小檗碱、血根碱和罂粟碱合成的最后一步，这些化合物都具有药用潜力。体外生化验证已证明这些反应均由植物中的FAD依赖氧化还原酶家族催化，包括小檗碱合成中的STOX和血根碱和罂粟碱合成中的二氢苯并菲啶氧化酶（DBOX）。然而，在酵母等异源宿主中验证这些相应氧化还原酶的体内活性仍然困难。特别是小檗碱合成中C. japonica来源的CjSTOX在酵母、大肠杆菌和加州罂粟中均未表现出体内活性（观察到副反应，将螺旋雀碱转化为去氢螺旋雀碱以及风石竹碱转化为黄连碱）。在本研究中，我们通过在模式植物本氏烟草中瞬时表达验证了CjSTOX将四氢小檗碱转化为小檗碱的活性。尽管进行了多种工程化尝试，CjSTOX在酵母系统中仅显示出微弱甚至无活性。将工程化的CjSTOX定位于酵母ER膜、液泡膜或液泡内部均未提高小檗碱的产量，尽管植物细胞中的STOX被报道定位在ER和液泡上。缺乏辅因子曾是阻碍异源植物酶在酵母中功能性表达的常见瓶颈，但我们推测FAD在工程化酵母中供应充足，因为另一种FAD依赖的氧化还原酶BBE在酵母中表现出活性。未来研究可以通过探索辅助蛋白的参与或BIAs的细胞间运输等可能性来解决这一挑战。

化学氧化为解决酵母中STOX不活跃问题提供了一种替代方案。由于发酵过程中小檗碱的生产可能源于自发转化，我们假设并证明了加热和生物反应器中更高的氧气传递可将转化率提高29.8倍，从35.1 μg L⁻¹提高至1.08 mg L⁻¹。近期一项关于罂粟碱生物合成的研究报告了类似的瓶颈，FAD依赖的氧化还原酶DBOX在酵母中不活跃，该研究使用类似策略，通过过氧化物和加热条件将四氢罂粟碱转化为罂粟碱。半生物合成已被证明是生产青蒿素和长春碱等高价值且合成难度较大的植物天然产物的可行方法。我们的加热化学转化以及结合过氧化物和加热的报道转化均证明，温和的化学转化可以弥补功能性酶的缺乏，为未来工业应用提供了一种多功能且便捷的方法。

在天然产物中进行结构修饰（如卤化）是提高其生物利用度和生物活性的一种常见方法。近年来，改造的BIA因其广泛的药理特性成为备受关注的目标。卤代BIA已被报道具有增强的生物活性，如氯小檗碱对葡萄糖吸收的影响和氟代阿朴菲啶对神经递质受体的作用，展示了卤代BIA在药物设计中的巨大潜力。在之前关于酵母中罂粟碱合成的研究中，已通过3-F/Cl-酪氨酸合成了8-F-牛心果碱和8-Cl-牛心果碱，经历了七个体内酶促反应。在我们准备提交本手稿时，另一组研究通过体外酶促途径使用不同底物在四到五个级联反应中合成了多种卤代去甲乌药碱和乌药碱衍生物。我们使用一组不同的植物酶和途径优化策略，使得3-F-酪氨酸在体内的整合得以延伸至11-F-THCB（共经历九个酶促反应）。该成果展示了在更长途径中体内整合卤代中间体的能力。进一步针对CAS酶的底物结合位点进行酶工程改造，有望解决最后一步缺失的酶促转化，以生产下游的F-四氢小檗碱和F-小檗碱。

本研究中产生的大多数卤代BIA经LC-MS/MS鉴定为3'-F-BIA，表明F-酪氨酸通过4HPAA途径而非先前罂粟碱生产菌株的多巴胺途径整合。偏好4HPAA途径可能是由于四个4HPAA降解相关的酵母内源基因被删除，且使用了植物来源的TyrH而非哺乳动物TyrH。差异表明可以通过调整4HPAA和多巴胺途径之间的代谢通量平衡来控制卤化位点。4HPAA途径的更多通量将导致3'-F-BIA的比例更高，而相反的条件则会使8-F-BIA占多数。此外，这种平衡可能影响双氟BIA的生产，该类化合物需要F-酪氨酸同时通过两条途径整合。在本研究中，我们观察到上游化合物乌药碱的3'-F和8-F卤化，以及8, 3'-二氟-乌药碱，这是在酵母中首次合成的双氟BIA化合物。未观察到进一步的8-F和双氟BIA，可能是由于多巴胺途径中F-BIA通量的缺乏。优化后的菌株若能平衡多巴胺和4HPAA途径的上游通量，将有助于生产更多双氟BIA，对新药研发和开发具有重要意义。

方法

化学试剂、基因、试剂盒和引物

酵母氮源（YNB）和氨基酸混合物购自Sunrise Science Products。硫酸铵、二硫苏糖醇（DTT）、3-氟-酪氨酸、3-氯-酪氨酸、3-碘-酪氨酸、小檗碱标准品和四氢小檗碱标准品购自Sigma-Aldrich。其他所有化学试剂均购自VWR International或Fisher Scientific。

外源基因的编码序列（见补充数据2）已针对酿酒酵母的表达进行密码子优化，由TWIST Bioscience合成。引物（见补充数据3）由Life Technologies合成。

Q5高保真2X母液、Gibson组装母液、DNA梯度标尺和凝胶加载染料购自New England Biolabs。Gateway LR Clonase II酶混合物购自Life Technologies。质粒小提试剂盒、凝胶DNA回收试剂盒、大肠杆菌转化试剂盒、酵母基因组提取试剂盒和Frozen-EZ酵母转化试剂盒购自Zymo Research。

质粒构建

本研究中使用的质粒列于补充表S1。外源基因使用Gibson组装技术，通过Gibson组装母液装配在载体质粒上。合成的基因通过Q5 DNA聚合酶PCR扩增。载体质粒骨架（pE系列）与设计的启动子和终止子配对，也通过PCR扩增。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证，并按制造商的说明通过凝胶DNA回收试剂盒纯化。用于酵母表达的质粒（pAG系列）和植物瞬时表达的质粒（pCambia2300系列）通过Gateway LR Clonase II酶混合物构建。

大肠杆菌感受态细胞使用大肠杆菌转化试剂盒，按制造商的说明制备。含有质粒的大肠杆菌菌株在LB培养基中培养，温度为37°C，适量加入50 μg mL⁻¹的卡那霉素或100 μg mL⁻¹的羧苄青霉素。质粒通过质粒小提试剂盒提取，按制造商的说明操作，并通过NanoDrop One（ThermoFisher Scientific）测量浓度，随后进行Sanger测序（由康奈尔生物技术研究所或GENEWIZ完成）。

酵母菌株构建

酵母基因组整合通过电转化完成，方法参照先前报道。途径基因、选择标记和500 bp基因组同源区域通过PCR从载体质粒或酵母基因组上扩增，相邻片段之间留有30–40 bp的重叠区。扩增的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳验证，从琼脂糖凝胶中切片纯化后，以等摩尔比电转化进入酵母，电转化条件为540 V、25 μF和无限电阻，使用Gene Pulser Xcell Total System电转化仪（Bio-Rad）。细胞随后在1 mL YPD中于30°C下恢复2小时，并在选择平板上铺板培养2–4天。如果需要，通过在质粒上表达Cre重组酶来回收整合选择标记，然后在SD平板上进行复制印迹选择，并在YPD中培养48小时以回收Cre质粒。

对于质粒表达，使用Frozen-EZ酵母转化II试剂盒制备化学感受态酵母细胞。每次转化中使用200 ng的质粒，按制造商的说明操作。如果选择标记是HygR，则在1 mL YPD中于30°C下培养2小时。转化后的细胞在选择平板上铺板培养2–4天。

培养和试管发酵条件

为了生产小檗碱，首先将酵母菌落在含1 mL YPD（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖）的14 mL Falcon管中于30°C培养过夜。然后将150 µL培养物稀释至3 mL新鲜的YPD中，重复培养三天。如果需要，在YPD中添加200 mg L⁻¹的潮霉素进行选择。对于卤代BIA的生产，培养基替换为含2%葡萄糖和100 mg L⁻¹卤代酪氨酸的SD-Tyr（0.17%酵母氮源、0.5%硫酸铵和1× -tyr氨基酸去除混合物）。发酵结束后，收集每个培养物300 µL，以15,000 rpm离心10分钟，取上清液200 µL并转移至Agilent 96孔板进行LC-MS分析。

为了通过化学氧化进一步提高小檗碱的产量，将培养上清液转移到PCR管中，每管100 µL，并在热循环仪中于98°C加热。

STOX的植物筛选

通过Gateway LR反应将STOX候选序列组装在pCambia2300质粒上。构建确认后，使用冻融法将其转化至农杆菌GV3101中，并在30°C下用含适量抗生素的LB琼脂平板上铺板培养两天。将单菌落在含有100 µg mL⁻¹羧苄青霉素、25 µg mL⁻¹利福平和30 µg mL⁻¹庆大霉素的4 mL LB中培养24小时，然后稀释至100 mL再培养24小时。以4000 rpm离心15分钟收集细胞，重悬于100 mL诱导缓冲液（10 mM MES，pH 5.6，10 mM MgCl₂，150 µM阿魏酮），30°C诱导3小时。诱导后的细胞再次沉淀并稀释至OD600为0.6。使用无针头的1 mL注射器将悬浮液渗入四周龄本氏烟草叶片的下表皮，每片叶约0.5–1 mL。每个构建的重复样本使用三片不同植物的叶片。基因表达四天后，将1 mg L⁻¹的四氢小檗碱溶于水渗入下表皮，约0.5–1 mL/叶。叶片一天后取出并保存在-80°C冰箱中，以供后续处理。

冷冻叶片经冷冻干燥后称量干质量。用含0.1%（v/v）甲酸的80%（v/v）甲醇溶液提取代谢物，提取量为每毫克干重10 µL。然后用Benchmark BeadBug 6匀浆器和3 mm珠子进行匀浆。提取的样品通过Pall AcroPrep 96孔过滤器过滤至Agilent 96孔板，用于LC-MS分析。

生物反应器发酵条件

小檗碱生产的初始种子培养取自平板上的新鲜单菌落，首先在含2 mL YPD的试管中于30°C培养过夜。每个培养物取1.25 mL接种到2×25 mL新鲜YPD中，在2×250 mL摇瓶中于30°C过夜培养，作为第二代种子培养。随后，将第二代种子培养物接种到2.5 L Eppendorf BioFlo 310反应器中的0.75 L YPD中，发酵条件为30°C、600 rpm，pH自动调节至7.0，使用1 M NaOH溶液。每次取样时收集1 mL培养物，使用NanoDrop测量OD600，然后离心后进行LC-MS分析。

代谢物的LC-MS和LC-MS/MS分析

代谢物通过与四极飞行时间质谱联用的高分辨率液相色谱（Agilent 1260 Infinity II/Agilent G6545B）在正离子模式下进行检测。每个样品注入1 µL，并在ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18柱（2.1×50 mm，1.8 µm）（Agilent）上分离，流动相为含0.1%甲酸的水（A）和含0.1%甲酸的乙腈（B）。二元泵梯度程序设定为：0–1分钟，95% A；1–11分钟，95–5% A；11–13分钟，5% A；13–14分钟，5–95% A；14–16分钟，95% A，流速为0.4 mL min⁻¹。检测卤代化合物时，使用更长的梯度程序：0–4分钟，95% A；4–44分钟，95–5% A；44–52分钟，5% A；52–56分钟，5–95% A；56–60分钟，95% A，流速为0.4 mL min⁻¹。使用ChemDraw软件计算目标化合物的[M + H]+加合物的m/z值，并用于提取离子色谱（质量误差低于50 ppm）进行化合物鉴定和定量。卤代BIA的鉴定采用三种碰撞能量水平（10, 20和40 eV）的串联质谱（MS/MS）模式，进样量调整为5 µL。

统计分析

图2c–f和补充图S3a的实验采用三个独立的生物重复。图2c, d的p值通过双尾t检验计算，误差条表示标准偏差。图3的实验误差条在72小时之前代表三个独立发酵的标准偏差，72小时之后代表两个独立发酵的范围。图2a, b和图4以及补充图S1、S4和S5的EIC曲线和MS谱代表三至五个独立重复。

软件

图表由Prism9（Graphpad）和PowerPoint 2019（Microsoft）生成。MassHunter Workstation（Agilent）用于收集和分析LC-MS和LC-MS/MS数据。化学结构图由ChemDraw 20.1（PerkinElmer）生成。

原文地址：https://blog.csdn.net/weixin_44874487/article/details/143576975

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